《Nat Commun》解讀：去磷酸化抑制泛素化！

來源：發布時間：2025-02-13

結直腸AI （CRC）的發病機制是多方面的，涉及控制腸上皮細胞增殖、凋亡和存活的多種細胞信號通路的失調。Notch1在AI癥發展中發揮多種作用，目前尚不清楚是否存在能夠使裂解的Notch1跨膜/細胞內區（NTM）去磷酸化以調節其功能的磷酸酶。雙特異性蛋白磷酸酶（DUSPs，也稱為MAPK磷酸酶）DUSP6是否參與和調節功能尚不清楚。

2024年11月，新加坡國立大學團隊在Nat Commun.（IF=14.7）上發表了題為“DUSP6 regulates Notch1 signalling in colorectal cancer”的研究成果。發現DUSP6是一種Notch1磷酸酶，揭示了Notch1在AI癥中的調控和功能，并為靶向Notch1信號開發人類疾病治L提供了新的途徑。

Highlights如下：

1）腫LIU 中DUSP6高表達與較差的CRC患者總生存率相關；

2）DUSP6促進細胞生長和遷移；

3）小鼠中DUSP6的缺失導致結腸腫LIU 發展減少；

4）機制上，DUSP6使Notch1 phospho-Y2116去磷酸化，從而降低NTM泛素化，從而提高NTM的穩定性和轉錄活性，促進腫LIU 細胞生長。

備注：Notch1在AI癥中的激HUO是通過Notch1細胞內結構域的磷酸化來調節的。Notch1的激HUO是通過結合其配體，δ樣蛋白1和3，或Jagged 1和2來啟動的。隨后經蛋白水解裂解，釋放Notch細胞內結構域（NICD）， NICD易位到細胞核中轉錄增殖相關基因，如c-Myc。NICD的磷酸化調控其穩定性，是決定其生物活性的關鍵過程。雖然已知裂解的NICD通過相應的激酶磷酸化可以調節生物活性，但磷酸酶的調節仍未被探索。NTM：Notch1跨膜/細胞內區。

臨床相關性：

腫LIU 中DUSP6高表達與與高NICD水平和較差的CRC患者總生存率相關。

功能研究：

DUSP6表達升高導致CRC細胞體外和體內增殖增強，小鼠中DUSP6的缺失導致結腸腫LIU 發展減少。

機制研究：

（1）DUSP6抑制MAPKs的激HUO，增加Notch1 NTM的水平

第一步，DUSP6抑制MAPKs的激HUO

DUSP6已被證明主要靶向ERK1/2。WB檢測顯示，過表達DUSP6導致ERK1/2、p38和JNK的激HUO降低，敲除DUSP6則增加其激HUO（圖1a）。另外，過表達DUSP6增加了增殖相關基因COX2和c-MYC的表達，DUSP6的缺失則相反（圖1a-1b）。

第二步，DUSP6增加Notch1 NTM的水平

據報道Notch1與CRC患者預后較差相關。Notch1作為一種跨膜受體蛋白，其激HUO需要γ-分泌酶對其進行蛋白水解裂解，釋放被裂解的Notch1細胞內區域，用于靶標增殖相關基因的轉錄激HUO或與其他細胞因子的合作。Notch1切割量的變化會對細胞增殖產生積極影響。DUSP6的過表達導致NTM（Notch1一個短的細胞外近膜肽和一個分子量為120 kDa的跨膜序列）水平升高，而敲除DUSP6導致NTM水平降低（圖1c）。表明DUSP6的表達與NTM水平呈正相關。

圖1 DUSP6抑制MAPKs的激HUO，增加Notch1 NTM的水平（Ref. Fig 2/S4）

（2）DUSP6抑制泛素介導的NICD蛋白酶體降解

被切割的Notch1細胞內區域作為轉錄激HUO因子，激HUO參與腫LIU 發育的各種基因。切割的Notch1細胞內區域活性可以通過磷酸化來調節，以標記泛素介導的蛋白酶體降解。然而，沒有報道任何負調節因子可以使Notch1細胞內區域去磷酸化，從而保持其細胞活性/豐度。DUSP6與NTM水平的相關性提示DUSP6可能調控NTM。

第一步，DUSP6與NTM結合

Co-IP實驗顯示內源性NTM可與細胞中flag-DUSP6結合；同時，內源性DUSP6可與HA-NTM結合（圖2a-b）。表明DUSP6與NTM結合。

第二步，DUSP6能夠直接使NTM去磷酸化

體外去磷酸化實驗發現，與DUSP6孵育后，NTM上總磷酪氨酸的數量減少了約55%（圖2c）。同樣，DUSP6能夠使內源性NTM去磷酸化（圖2d-e）。表明DUSP6能夠直接使NTM去磷酸化。

第三步，DUSP6對NTM的去磷酸化可以降低NTM的泛素化

接下來，進行連續的去磷酸化和泛素化實驗，以測試DUSP6對NTM的去磷酸化是否會導致泛素化降低。純化NTM，然后與DUSP6孵育進行去磷酸化。然后將所得的NTM用作體外泛素化試驗的樣本。結果顯示，NTM與DUSP6孵育后檢測到總磷酪氨酸減少，同時，去磷酸化NTM上的泛素化量減少了約38%（圖2f）。表明，DUSP6對NTM的去磷酸化可以降低NTM的泛素化。

第四步，DUSP6抑制NTM泛素化以增強其穩定性

接下來，探索DUSP6引發的NTM泛素化降低是否會導致蛋白酶體介導的降解變化。敲減DUSP6并使用MG132（一種有效的蛋白酶體抑制劑）處理細胞，檢測NTM的水平。發現DUSP6敲減，NTM明顯降低；MG132處理后，NTM水平增加（圖2g）。此外，Co-IP實驗分析顯示DUSP6與NTM泛素化水平負相關，與NTM水平正相關（圖2h）。表明DUSP6抑制NTM泛素化以增強其穩定性。

圖2 DUSP6抑制泛素介導的NICD蛋白酶體降解（Ref. Fig 5/S7）

（3）DUSP6對Notch1的phospho-Y2116的去磷酸化是其調控CRC細胞增殖的關鍵

功能回復實驗顯示，DUSP6通過Notch1調控結直腸AI 細胞增殖（圖3a-b）。隨后IP-MS篩選NTM上可能被DUSP6靶向的磷酸化位點。NTM中總共檢測到17個磷酸絲氨酸、3個磷酸蘇氨酸和2個磷酸酪氨酸，其中只有phospho-Y2116（p-Y2116）是DUSP6過表達時失去磷酸化的酪氨酸殘基。此外，兩個絲氨酸殘基S1951和S2205在DUSP6 過表達中也失去了磷酸化。

為了確定p-Y2116、p-S1951和p-S2205在Notch1信號傳遞中的重要性，構建Notch1失活突變體Y2116A、S1951A和S2205A，通過CSL（CBF1/RBP-Jκ）報告基因和Notch1通路報告基因檢測。發現DUSP6過表達導致Notch1介導的轉錄活性增加，NICD Y2116A的細胞中轉錄活性增加（圖3c）。表明在這三種突變中，只有Y2116A突變使NTM具有逃避泛素化和隨后的蛋白酶體降解的能力。隨后的功能實驗也顯示NTM WT和NTM Y2116A均能挽救DUSP6 KO細胞增殖減少的情況（圖3d）。表明Y2116是DUSP6控制Notch1活性的磷酸化位點。

圖3 DUSP6對Notch1的phospho-Y2116的去磷酸化是其調控CRC細胞增殖的關鍵（Ref. Fig 6）

結論：研究人員發現DUSP6可以作為Notch1的磷酸酶，從而調節NTM的穩定性和轉錄活性，從而影響結直腸AI （CRC）的發展。腫LIU 中DUSP6高表達與較差的CRC患者總生存率相關，DUSP6表達升高與NTM水平升高相關。DUSP6過表達導致CRC細胞體外和體內增殖增強，DUSP6缺乏導致結直腸AI 發展減少。在機制上，DUSP6使Notch1 phospho-Y2116去磷酸化，從而降低NTM泛素化，從而提高NTM的穩定性和轉錄活性。為靶向Notch1信號開發人類疾病治L提供了新的途徑。