雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出,30年后因為有了激光才得到實驗驗證,但是到WinfriedDenk發明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用,首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生非線性過程,這要求極高的電場強度,而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,脈寬越窄,雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關,所以關鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析,能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優勢:只有焦平面處才能形成雙光子吸收,而焦平面之外由于光強低無法被激發,所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態光源優勢,鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍,而近紅外相比可見光穿透更深,對生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡可以進行厚的組織樣品拍攝。激光雙光子顯微鏡價格
TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纖激光器是一種易于操作和免維護的激光系統其輸出波長為920nm,非常適合常規熒光基團(如GFP、eGFP、曙紅、GCaMP、CFP、鈣黃綠素或金星)的雙光子激發。它可以為熒光基團提供相對較高的峰值功率,常用于神經科學和其他與激光相關的光子學。此外,其獨特的設計(簡單和經濟的光源)具有創新雙光子熒光顯微鏡發展的潛力。在雙光子顯微鏡中,峰值功率就是亮度!如果你想獲得更好的圖像亮度,那么你需要短脈沖,高功率,更重要的是,干凈的時間脈沖形狀。FemtoFiberultra920具有足夠高的輸出功率、短脈沖、獨特的Clean-Pulse技術和相對較高的峰值功率,這使得在雙光子顯微鏡中實現****亮度而無需對樣品進行不必要的加熱成為可能。FemtoFiberultra920全包式、完全集成的色散補償(可確保樣品處的短脈沖)、內置電源控制、直觀的操作及其堅固緊湊的設計使系統具有非常友好的用戶體驗,是非線性顯微鏡應用的良好解決方案。例如,熒光蛋白的雙光子激發和基于SHG的對比機制美國ultimainvestigator雙光子顯微鏡作用對于顯微成像技術包含:寬場熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、轉盤共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡。
1990年初,當WinfriedDenk剛從康奈爾大學博士畢業準備前往瑞士讀博后時,他看了一本關于激光掃描顯微鏡的書,從中了解到非線性光學效應——強光和物質的相互作用。當時,Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學元件,于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外,換言之,與其通過一個紫外光子激發標記的鈣離子,通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發相同的熒光。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器,Denk聯合他的導師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建,采集數據則用了兩到三天,于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。
新一代微型化雙光子熒光顯微成像系統的成功研制是國家重大科研儀器研制專項的一個碩果。它彰顯了北京大學在生物醫學成像領域先期布局的前瞻性,鍛煉了一支以年輕PI和碩博研究生為主體、具有學科交叉背景和重要技術創新能力的“中國智造”隊伍。目前,該研發團隊正在領銜建設“多模態跨尺度生物醫學成像”十三五國家重大科技基礎設施,積極參與即將啟動的中國腦科學計劃。可以期待,微型化雙光子熒光顯微成像系統將為實現“分析腦、理解腦、模仿腦”的戰略目標發揮不可或缺的重要作用雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細胞進行特定實驗;
相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西,冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子,而雙光子顯微鏡有什么優勢呢?它能做到什么普通光學顯微鏡做不到的事情嗎?原來,雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、***觀察!由于電磁波的波長越短,粒子性越強,受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發光源改為長波長激光,在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性。除此之外,因為只有物鏡焦點處能發生雙光子激發效應,所以掃描的精確度極高,也能提高激發光效率,減少被掃描點之外的熒光物質消耗。雙光子顯微鏡的原理是什么?美國ultimainvestigator雙光子顯微鏡作用
雙光子顯微鏡成像技術及不同轉基因小鼠開展對多種臟器的成像研究。激光雙光子顯微鏡價格
配合雙光子激發技術,激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發揮功效。那么,什么是雙光子激發技術呢?在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,經過一個很短的時間后,電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子(P=h/λ)。利用這個原理,便誕生了雙光子激發技術。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光,通過物鏡匯聚,由于雙光子激發需要很高的光子密度,而物鏡焦點處的光子密度是比較高的,所以只有在焦點處才能發生雙光子激發,產生熒光,該點產生的熒光再穿過物鏡,被光探頭接收,從而達到逐點掃描的效果。激光雙光子顯微鏡價格