bruker雙光子顯微鏡的原理

臨研所、病理科和科研處邀請北京大學王愛民副教授在2020年12月22日做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統介紹及其在臨床醫療診斷”的學術報告。學術報告由臨研所醫學實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民，北京大學信息科學技術學院副教授，畢業于北京大學物理系，獲學士、碩士學位，后于英國巴斯大學物理系獲博士學位。該研究組研發的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經元和神經突觸清晰穩定的動態信號，該成果獲得了2017年度“中國光學進展”和“中國科學進展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術在臨床診斷中的應用，為未來即時病理、離體組織檢測、術中診斷等提供新型的影像手段和分析方法。雙光子顯微鏡明日之星--FemtoFiber ultra 920 。bruker雙光子顯微鏡的原理

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優點：☆穿透能力強：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區域內可以激發出熒光，雙光子吸收局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內；☆漂白區域小：由于激發只存在于交點處，所以焦點以外的區域都不會發生光漂白現象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學濾波器（共焦），這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高。美國bruker雙光子顯微鏡成像視野雙光子顯微鏡在多個領域研究中已有許多成功實例。

相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優勢呢？它能做到什么普通光學顯微鏡做不到的事情嗎？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點、***觀察！由于電磁波的波長越短，粒子性越強，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性。除此之外，因為只有物鏡焦點處能發生雙光子激發效應，所以掃描的精確度極高，也能提高激發光效率，減少被掃描點之外的熒光物質消耗。

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態光源優勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡可精確穿透較厚標本進行定點、有生命體的觀察！

細胞內鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當個細胞興奮時，產生了一個電沖動，此時，細胞外的鈣離子流入該細胞內，促使該細胞分泌神經遞質，神經遞質與相鄰的下一級神經細胞膜上的蛋白分子結合，促使這一級神經細胞產生新的電沖動。以此類推，神經信號便一級一級地傳遞下去，從而構成復雜的信號體系，終形成學習、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經系統中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態下大部分神經元細胞內鈣離子濃度約為50-100nM，而細胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經遞質的過程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學活性，而細胞質內鈣離子濃度由鈣離子的內外流平衡所決定，同時也受鈣結合蛋白的影響。細胞外鈣離子內流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等。神經元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現出來，以反映神經元活性。該方法可以同時去觀察多個功能或位置相關的腦細胞。雙光子顯微鏡觀察到的現象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發的鈉離子作用電勢。國內ultima2PPLUS雙光子顯微鏡掃描深度

雙光子顯微鏡知多少。bruker雙光子顯微鏡的原理

隨著技術的發展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優化，結合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優化與標本改造。關于裝置優化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關于標本，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質將標本浸泡，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質電解，進而讓標本“透明度”提高。bruker雙光子顯微鏡的原理