HIF-1a免疫熒光

免疫熒光實驗的注意事項：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗時需設置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標本自發熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。②特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。③陽性對照：已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。如果標本自發熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。一般標本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現象，經熒光染色的標本較好在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。免疫熒光技術可以用于研究細胞信號傳導和信號通路。HIF-1a免疫熒光

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性，經過短暫的間隔（發射光譜）后以較高的波長發射光子，并伴隨能量損失。發射的熒光可通過顯微鏡觀察到。熒光團可以通過可見光或紫外光激發。具有高光穩定性和熒光量子產率的熒光染料可在市場上購買，其激發較大值跨越從400到>700nm的波長范圍。它們不會損傷活細胞，可安全用于生物制劑。在進行免疫熒光檢測時，首先對細胞或組織進行固定和透化處理。進行免疫染色時，熒光團與目標抗原的抗體結合，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號。根據使用的抗體和所需的信號擴增，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型。mpo免疫抗體免疫熒光技術中，以熒光物質標記抗體來定位抗原物質的方法被稱為熒光抗體技術。

免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發生反應時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結合后，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。在此基礎上又分為兩種方法：直接法和間接法。直接法：將標記的特異性熒光抗體直接加到抗原上，經過一定時間反應，即可結合并顯色。間接法：先用抗原的抗體（一抗）與抗原反應結合，再用熒光標記的二抗（一抗的抗體）與抗原反應，形成抗體-抗原-抗體復合物。

免疫熒光注意事項：對照實驗的設置：1、內源性組織背景對照：某些細胞和組織可能有固有的生物學性質，會產生背景熒光，對結果產生影響，例如色素脂褐質。因此在孵育一抗前，應對樣品進行觀察，確?？乖旧頉]有信號。2、陽性對照：用確認含有待測抗原的組織或細胞，與待測標本進行統一處理，結果應為陽性，可證明待測抗原有一定活性并且實驗過程中用的試劑及方法均可靠。3、陰性對照：與陽性對照相反，用明確不含有待測抗原的細胞或組織切片染色，結果若為陰性，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結果。免疫熒光技術在生物醫學研究中具有普遍的應用前景。

細胞和組織樣品處理：準備熒光標記的細胞樣品：為實現較佳的圖像質量，首先應建立針對目的蛋白和細胞結構的研究，同時將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細胞樣品用于標記–首先將細胞結構、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細胞內部，標記目的靶點。封閉細胞樣品，防止熒光標記物與研究無關的蛋白非特異性結合，較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結合。免疫熒光技術可以用于研究藥物的靶點和作用機制。ZO-1免疫抗體

免疫熒光技術可以用于研究植物病理學和農業生產。HIF-1a免疫熒光

免疫熒光通透（目的是使抗體進入胞內），0.5%TritonX-100(一種去垢劑，用PBS配制)室溫通透20min（針對胞內抗原，若是細胞膜上表達的抗原則省略該步驟）；除了TritonX-100，也可作為通透劑，并且固定后的樣品不需要通透。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點進行結合），通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30min。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產生較高的背景。醛類固定的樣品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進行封閉。HIF-1a免疫熒光

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