南京分子生物學定量PCR研究方案

聚合酶鏈式反應：模板的制備，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、菌類等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫學標本有血斑、精斑、毛發等。標本處理的基本要求是除去雜質，并部分純化標本中的核酸。多數樣品需要經過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應模板。像所有酶一樣，DNA聚合酶也容易出錯，這反過來會導致產生的PCR片段發生突變。南京分子生物學定量PCR研究方案

聚合酶鏈式反應：RNA和DNA的五碳糖，前者比后者多了一個O，由于多出來的O原子造成了RNA和DNA的堿基不同，即O原子造成U和T的不同，U分子化學式C4H4N2O2，T胸腺嘧啶化學式C5H6N2O2，現在將兩個分子式進行對比，U比T多了CH2，結合前面的核糖區別，還有一個O分子，其余結構相同，那么O和CH2之間的聯系是什么?是什么導致DNA和RNA的區別是RNA比DNA多了O和CH2？或者說如何將病毒的堿基中U變成DNA堿基中的T？若從結構上說，直接從U中加入一個CH2，得到了T，這里面介入化學鍵的斷裂和重組，但是這樣一來的話，即使U變成了T，但是核糖依舊是RNA比DNA多了一個O分子，只是此時結構是某分子=核糖（C4H9O4CHO）+堿基（A T G C），形成了RNA的五碳糖+DNA的堿基這種分子了。此時將這種分子導入受體細胞（亦或者蛋白質）中，表達的性質一定不同于病毒表達的性質。寧波骨頭Real-time PCR原理及步驟流聚合酶鏈反應：一種偽等溫PCR方法。

聚合酶鏈反應的一個主要限制是，為了產生允許其選擇性擴增的引物，需要關于目標序列的先前信息。這意味著，通常情況下，PCR用戶必須知道兩個單鏈模板中每個模板上目標區域上游的精確序列，以確保DNA聚合酶正確結合引物-模板雜交體，并隨后在DNA合成過程中產生整個目標區域。像所有酶一樣，DNA聚合酶也容易出錯，這反過來會導致產生的PCR片段發生突變。PCR的另一個限制是，即使是很少量的污染DNA也可以被擴增，導致誤導或模糊的結果。為了很大限度地減少污染的可能性，調查人員應該為試劑制備、聚合酶鏈反應和產品分析預留單獨的房間。試劑應分配到一次性的等分試樣中。應經常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器。

聚合酶鏈式反應的試驗污染：實驗室中克隆質粒的污染：在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。污染的監測：一個好的實驗室，要時刻注意污染的監測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。重復性試驗。選擇不同區域的引物進行PCR擴增。聚合酶鏈式反應的特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

聚合酶鏈式反應的試驗污染：PCR反應的很大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人腦袋不適的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。 污染原因：標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。熱啟動/冷完成聚合酶鏈反應是通過新的雜合聚合酶實現的，這些酶在環境溫度下不活躍。深圳血液定量PCR原理

聚合酶鏈反應五要素：參加PCR反應的物質主要有五種即：引物、酶、dNTP、模板和緩沖液。南京分子生物學定量PCR研究方案

聚合酶鏈式反應的試驗污染：PCR擴增產物污染：這是PCR反應中很主要很常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml），遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可形成假陽性。還有一種容易忽視，很可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。南京分子生物學定量PCR研究方案

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