黃山實時定量PCR

聚合酶鏈式反應的特點：特異性強，PCR反應的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結合；堿基配對原則；Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合（復性）可以在較高的溫度下進行，結合的特異性增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。聚合酶鏈式反應是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。黃山實時定量PCR

聚合酶鏈反應：流聚合酶鏈反應:一種偽等溫PCR方法。將溶液置于熱梯度下，而不是反復加熱和冷卻聚合酶鏈反應混合物。由此產生的熱不穩定性驅動對流流動自動將聚合酶鏈反應試劑從熱區域和冷區域打亂，從而反復啟動聚合酶鏈反應。通過利用混沌流場的出現，可以優化熱邊界條件和PCR外殼的幾何形狀等參數，以產生特異和快速的PCR。這種對流聚合酶鏈反應設置明顯降低了設備功率需求和操作時間。逆轉錄聚合酶鏈反應(逆轉錄-聚合酶鏈反應):用于從RNA中擴增DNA。逆轉錄酶將核糖核酸逆轉錄成cDNA ，然后通過聚合酶鏈反應進行擴增。逆轉錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜，以確定基因的表達或鑒定RNA轉錄物的序列，包括轉錄起始和終止位點。如果基因的基因組DNA序列是已知的，逆轉錄-聚合酶鏈反應可以用來繪制基因中外顯子和內含子的位置。基因的5’端(對應于轉錄起始位點)通常通過 RACE-PCR (快速擴增cDNA末端)中。黃山實時定量PCRPCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克量級的起始待測模板擴增到微克水平。

現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。檢測：PCR反應擴增出了高的拷貝數，下一步檢測就成了關鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是很常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。

聚合酶鏈式反應：因為PCR擴增了目的DNA區域，所以PCR可以用于分析極少量的樣品。這對于法醫檢定法，當時只有微量的DNA可作為證據。聚合酶鏈反應也可用于分析古代DNA那已經有數萬年的歷史了。這些基于聚合酶鏈反應的技術已經成功地應用于動物身上，例如四萬年前猛犸，以及人類DNA，應用范圍從分析埃及木乃伊識別一個俄羅斯沙皇和英國國王理查三世遺體的鑒定。定量聚合酶鏈反應或者實時聚合酶鏈反應不要與逆轉錄-聚合酶鏈反應方法混淆)允許估計樣品中存在的給定序列的量——這種技術通常用于定量確定基因表達的水平。定量PCR是一種已建立的DNA定量工具，用于測量每輪PCR擴增后DNA產物的積累。流聚合酶鏈反應：一種偽等溫PCR方法。

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：PCR產物量過少：退火溫度不合適。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。DNA模板量太少。增加DNA模板量。PCR循環數不足。增加反應循環數。引物量不足。增加體系中引物含量。延伸時間太短。以1 kb/min的原則設置延伸時間。變性時間過長。變性時間過長會導致DNA聚合酶失活。DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈。擴增產物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散：酶量過高。減少酶量；酶的質量差，調換另一來源的酶。dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。聚合酶鏈反應的一個主要限制是，為了產生允許其選擇性擴增的引物，需要關于目標序列的先前信息。連云港血液熒光PCR原理及步驟

PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成。黃山實時定量PCR

逆轉錄-聚合酶鏈反應的原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。完整RNA 的提取和純化，是進行RNA 方面的研究工作，如Nothern雜交、mRNA 分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。所有ＲＮＡ的提取過程中都有五個關鍵點，即樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使白復合體變性；對內源ＲＮＡ酶的有效抑制；有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去。但其中很關鍵的是抑制RNA酶活性。RNA 的提取目前階段主要可采用兩種途徑，提取總核酸，再用氯化鋰將RNA 沉淀出來；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質進入有機相而RNA 留在水相。種提取方法將導致小分子量RNA 的丟失，目前該方法的使用頻率已很低。黃山實時定量PCR