40KPEI轉染試劑轉染步驟

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細胞分盤：通過胰酶消化收集細胞，用適當的完全培養基以4×105至8×105細胞/cm2的密度平鋪細胞于60mm組織培養皿上（根據實驗需要選擇培養皿，使細胞貼壁后所占總面積達到培養皿面積的70-90％）。根據細胞貼壁情況于含5％CO2的37℃溫箱中孵育8-24h,當細胞貼壁完全后即可開始轉染。轉染前換入2mL預熱的無血清培養基。2.制備PEI-DNA混合物：以60mm組織培養皿用420μL反應總體積為例。準備兩支1.5mL離心管，一管將質粒DNA（總量2-8μg為佳）加入240μLHBS中，混勻。另一管中則用HBS將100μM的PEI儲存液稀釋成10μM，充分混合。然后取180μL10μMPEI溶液加入含有DNA的HBS中，充分混勻后室溫靜置20-30min。將這420μL的PEI-DNA混合液逐滴加入上述單層細胞的細胞培養基中，輕輕搖動平皿混勻，置于含5％～7％CO2的37℃溫箱孵育。注：每次用100μM的PEI儲存液前都需要先將其充分混勻，保證所取的濃度一致。3.培養6-10h后更換為37℃預熱的含有血清的培養基，繼續培養，16h左右可以觀測到報告基因的表達。

陽離子聚合物PEI轉染試劑使用比例PEI轉染試劑是否有毒性？

PEI在于可以應用于體內試驗。當初試驗經費很有限，被逼無奈只能放棄脂質體2000，選擇PEI，以至于相當長的時間內，轉染試驗都不順利。下面是幾點關于PEI轉染的注意要點：1.PEI的使用量可以參照脂質體2000的說明書，所用質粒盡量去內2.轉染時，一定要把PEI+DMEM加入到質粒+DMEM中，順序不可錯，輕微混勻，靜止20min3.轉染后4小時，一定要換液！換含有FBS的完全培養液！因為PEI對細胞毒性太大4.如果后續試驗涉及到穩定篩選，建議把血清濃度適當提高。PS：事實證明，PEI是可行的，已經做出穩定細胞系了。

化學轉染方法是生物醫學研究中常用的轉染方法，主要包括兩類：陽離子脂質體和陽離子聚合物。其基本原理是利用陽離子的化學分子與帶有負電荷的核酸通過正負電荷作用形成穩定的復合物。一方面使復合體整體帶上正電荷（多數細胞膜表面帶有弱的負電荷，通過電荷作用吸引復合體到細胞膜表面）；另一方面對線性的核酸進行濃縮，使其體積變小更易穿透細胞膜。陽離子聚合物類轉染試劑可以說是貧窮實驗室的福音了。早在2012年就有研究小組在大名鼎鼎的Nature Protocol上發表了PEI作為轉染試劑的詳細方法，到現在被越來越多的實驗室采用。更多關于Polysciences PEI相關產品內容歡迎咨詢上海曼博生物醫藥科技有限公司！用PEI轉染試劑時出現沉淀什么原因？

穩定轉染方法: 

1.接種細胞：轉染前，用膠原酶（WORTHINGTONG公司LS004196)消化細胞并計數（不建議用胰酶）。調整細胞濃度，將細胞鋪入細胞培養的器皿，每個孔置入的細胞量應能使轉染時細胞匯合度達到70~80%。2.準備DNA-PEI復合物：DNA、PEI試劑和稀釋劑在進行以下步驟前需先使其升至室溫。依據表1所示，用Opti-MEMITM（Invitrogen）或其他適合的無蛋白培養基稀釋適量DNA。用同樣的培養基稀釋PEI試劑。每1μgDNA需用1.5-5μL線性PEI轉染試劑(這個需要客戶自行摸索配比，每一批轉染試劑和每一批DNA比例可能會稍有不同）。一邊輕輕渦旋裝有DNA溶液的試管，一邊將稀釋的線性PEI轉染試劑滴加至試管中（注意：請勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置10~25min以形成DNA-PEI復合物。當溶液體積較大時，請用圓底聚丙烯管，例如NEST5mL/14mL離心管。 PEI轉染試劑的工作原理是什么？無動物源成分PEI轉染試劑價格

哪個品牌的PEI轉染試劑轉染效率高呢？40KPEI轉染試劑轉染步驟

特別提醒：

1.對于某些類型的細胞如HEK-293、HEK293T、NIH/3T3和COS細胞，在轉染前兩天鋪板可顯著提高轉入基因的表達水平。如果選擇轉染前兩天鋪板，可適當降低鋪板密度，以確保轉染時細胞的匯合度仍為70~80%。2.對于接觸抑制敏感的細胞，可適當降低鋪板密度。3.即使在有蛋白（如10%的血清）存在的情況下，DNA-PEI復合物仍能轉染細胞，但是DNA-PEI復合物必須在無蛋白存在的條件下形成。我們推薦使用Opti-MEMITM培養基以達到*轉染效率。其他的無蛋白培養基則需測試與線性PEI轉染試劑的兼容性。4.對大多數細胞來而言，每1μgDNA使用3.0μLEndoFectinTM試劑都能獲得較高轉染效率。使用者也可嘗試每1μgDNA使用1~4μL體積線性PEI轉染試劑進行優化。 40KPEI轉染試劑轉染步驟

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