國內熒光雙光子顯微鏡作用

新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小，重只2.2克，適于佩戴在小動物頭部顱窗上，實時記錄數十個神經元、上千個神經突觸的動態信號。在大型動物上，還可望實現多探頭佩戴、多顱窗不同腦區的長時程觀測。相比單光子激發，雙光子激發具有良好的光學斷層、更深的生物組織穿透等優勢，其橫向分辨率達到0.65μm，成像質量與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美，遠優于目前領域內主導的、美國腦科學計劃重要團隊所研發的微型化寬場顯微鏡。采用雙軸對稱高速微機電系統轉鏡掃描技術，成像幀頻已達40Hz（256*256像素），同時具備多區域隨機掃描和每秒1萬線的線掃描能力。此外，采用自主設計可傳導920nm飛秒激光的光子晶體光纖，該系統實現了微型雙光子顯微鏡對腦科學領域較廣泛應用的指示神經元活動的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用。同時采用柔性光纖束進行熒光信號的接收，解決了動物的活動和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題。未來，與光遺傳學技術的結合，可望在結構與功能成像的同時，精細地操控神經元和神經回路的活動。雙光子顯微鏡明日之星--FemtoFiber ultra 920 。國內熒光雙光子顯微鏡作用

與普通顯微鏡相比，電子顯微鏡可以在更小的尺度上觀察事物，冷凍電子顯微鏡可以觀察活性生物大分子。雙光子顯微鏡有什么優勢？它能做普通光學顯微鏡做不到的事情嗎？原來雙光子顯微鏡可以準確穿透厚標本進行定點和***觀察！因為電磁波的波長越短，粒子越強，散射的影響越大。雙光子顯微鏡將激發光源改為長波長激光，增加了激光的穿透力，同時降低了對細胞的毒性。此外，由于雙光子激發效應只能發生在物鏡的焦點處，因此掃描精度極高，還可以提高激發光效率，減少掃描點以外的熒光物質的消耗。國外激光雙光子顯微鏡熒光壽命計數雙光子顯微鏡的應用中，該如何選擇以及更好的使用PMT。

共聚焦顯微可以呈現這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的，任何事物都有優缺點，何況一臺儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內的的樣品，對于厚的或者樣品不能進拍攝；2.共聚焦顯微鏡由于是逐點進行掃描，對樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細胞樣品時就更容易對樣品進行淬滅；3.由于光照射的區域幾乎能通過這個Z軸的層面，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進行激發，對于一些特殊激發波長的實驗，效率非常低。

雙光子顯微鏡是一種先進的成像技術，可以在保持細胞活性的情況下，對深層組織進行高分辨率成像。它主要用于生物學、醫學和材料科學等領域的研究。雙光子顯微鏡的重心技術是基于雙光子激發的熒光成像。當激光通過樣品時，它會吸收特定波長的光子，然后發出熒光。雙光子顯微鏡使用兩個連續的光子同時激發樣品，這樣可以在保持樣品完整性的同時，獲得高質量的圖像。雙光子顯微鏡具有以下優點：1.高分辨率：由于雙光子激發的特性，它可以獲得比傳統顯微鏡更高的分辨率。2.深層成像：由于激光的穿透深度限制，傳統的光學顯微鏡無法對深層組織進行成像。而雙光子顯微鏡可以解決這個問題，因為它可以激發樣品的深層熒光。3.活細胞成像：雙光子顯微鏡可以在保持細胞活性的情況下進行成像，這對于研究細胞生理學和生物化學過程非常有用。4.多模式成像：雙光子顯微鏡可以結合多種技術，如光譜成像、鈣離子成像和神經活動成像等，以提供更豐富的生物樣品信息。總之，雙光子顯微鏡是一種強大的研究工具，可以對深層組織和活細胞進行無損成像。這使得它在生物學、醫學和材料科學等領域的研究中具有廣泛的應用。雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為光源。

首先，雙光子成像采用波長范圍約在700~1000nm的近紅外光激發，在組織中的散射系數較小，穿透性很好，因此非常適合厚樣本的觀察。同時，由于是近紅外光激發，也能避免樣品中激發波長較短的自發熒光物質的干擾，可獲得較強的熒光信號（如下圖）。所以雙光子成像具有較深的穿透力和較小的光毒性。通常在活物腦組織中雙光子顯微鏡有效成像深度可達200~500μm，能夠較好地進行三維成像。雙光子成像的另一大優勢在于精確的空間點聚焦性。一般條件下，物質只會被單光子激發，只有在光子密度足夠高的情況下，物質才會吸收兩個光子從而被激發，所以，雙光子只會在光子密度蕞高的物鏡焦點附近發生，很少產生焦平面外的雜散光（如下圖）。這種性質既提高了成像質量，也降低了樣本的光漂白、光損傷區域。基于這些優勢，使得雙光子顯微鏡非常適合對活細胞、活組織進行長時間在體成像。對于顯微成像技術包含：寬場熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、轉盤共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡。國內激光雙光子顯微鏡光損傷

雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。國內熒光雙光子顯微鏡作用

新一代微型化雙光子熒光顯微成像系統的成功研制是國家重大科研儀器研制專項的一個碩果。它彰顯了北京大學在生物醫學成像領域先期布局的前瞻性，鍛煉了一支以年輕PI和碩博研究生為主體、具有學科交叉背景和重要技術創新能力的“中國智造”隊伍。目前，該研發團隊正在領銜建設“多模態跨尺度生物醫學成像”十三五國家重大科技基礎設施，積極參與即將啟動的中國腦科學計劃。可以期待，微型化雙光子熒光顯微成像系統將為實現“分析腦、理解腦、模仿腦”的戰略目標發揮不可或缺的重要作用國內熒光雙光子顯微鏡作用