美國超微顯微鈣成像nVista

想要對鈣離子的動態變化進行有效的檢測，鈣離子指示劑的選擇顯得尤為重要。鈣離子熒光指示劑在未結合鈣離子前幾乎無熒光，與鈣離子結合后，熒光強度xianzhu增強。利用這一原理，可以通過指示劑的信號強弱來觀察細胞內鈣離子濃度水平的變化。根據激發光波長范圍，鈣離子指示劑可以分為可見光激發和紫外光激發，而根據其工作原理又可以分為比率和非比率型。常見的鈣離子指示劑有以下幾種：紫外光激發Ca2+熒光探針、可見光激發Ca2+熒光探針、轉基因Ca2+指示劑。近年來出現了通過植入性的顯微鏡或透鏡進行活動動物鈣成像的技術。美國超微顯微鈣成像nVista

細胞內鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當神經細胞興奮時，會產生一個電沖動，在此時，細胞外的鈣離子回流入該細胞內，促使這個細胞分泌神經遞質，神經遞質與相鄰的下一級神經細胞膜上的蛋白分子相結合，促使這個一級神經細胞產生新的電沖動。以此類推，神經信號便一級一級地傳遞下去，從而構成復雜的信號體系，形成了學習、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經系統中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。重慶inscopix鈣成像口碑好利用鈣離子指示劑檢測組織或細胞內鈣離子濃度，進而反應組織或細胞內某些活動或反應。

對于成像和長時間成像，較重要的是要保證細胞的正常生長。熒光團受激發光光照后產生的氧化物質與蛋白質、核酸和脂肪等發生反應，熒光信號降低的同時（光致退色）也降低了細胞壽命（光線損傷）。在光照過程中氧化劑的產生,主要決定于熒光團的光化學性質和光照劑量,因此減少光照劑量成為解決上述問題的途徑之一。光漂白（Photobleaching）指在光的照射下熒光物質所激發出來的熒光強度隨著時間推移逐步減弱乃至消失的現象。熒光成像的質量很大程度上依賴于熒光信號強度，提高激發光強度固然可以提高信號強度，但激發光的強度不是可以無限提高的，當激發光的強度超過一定限度時，光吸收就趨于飽和，并不可逆地破壞激發態分子，這就是光漂白現象。在顯微技術中，光漂白使得觀測變得很復雜，因為它會造成破壞，使螢光團無法繼續放光，從而干擾實驗結果。

鈣成像的熒光指示劑鈣成像的熒光探針一般均為Ca2螯合劑EGTA，APTRA，BAPTA的衍生物，它們可以結合鈣離子從而顯示一個光譜響應，使研究者可以用熒光顯微鏡來觀察細胞內的自由鈣的濃度。熒光顯微鏡可以使用普通的倒置熒光顯微鏡來進行鈣信號的測定和成像。并可結合電生理設備、活細胞培養裝置等，適用于大強度、廣范圍的鈣信號測定。共聚焦顯微系統，共聚焦以激光為光源，且可配備氬離子光源，可以選擇可見光激發的鈣指示劑，進行層掃，相比普通熒光顯微鏡有更好的空間分辨率。并且共聚焦除了配備大視野掃描鏡更可配置共振掃描振鏡，以滿足更高速成像應用的需求。雙光子顯微系統使用長波長來激發熒光指示劑，具有較低的細胞毒性，也可適用于紫外激發的鈣指示劑，且可獲得和單光子共聚焦系統類似的空間分辨率。小結綜上可見，在研究鈣信號時，可結合樣品自身特點來選擇相應的鈣指示劑，并考慮既有的實驗設備，來確定具體的實驗方案。同時還需進一步摸索實驗數據的校正、控制等多種影響因素，可獲得可靠的圖像及熒光定量數據。專業的鈣成像顯微鏡使得鈣成像變的直接。

目前有三種在神經元上填充鈣離子指示劑的方法，且都可以用于體內和體外研究。第一種方法是利用玻璃吸管將膜滲透性鹽或葡聚糖形式的指示劑注入單個神經元中。此方法方便實驗者控制單個神經元內的鈣離子指示劑濃度且信噪比較高。第二種是利用“批量加載”的方法將鈣離子指示劑染料負載神經元，觀察對象為一群神經元。盡管此方法可能導致一些膠質細胞也被指示劑所標記，但提高了整體神經元的標記百分比，使研究者得以觀察到一群神經元內動作電位相關性的活動。第三種也較為常用，通過病毒轉染的方式使其基因編碼鈣離子指示劑。（A）單細胞注射法；（B）networkloading法；（C）通過病毒轉染使其基因編碼鈣離子指示劑（expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI）細胞內鈣成像技術是通過向細胞內載入鈣指示劑。上海在體鈣成像nVista

鈣信號在大腦皮層中更能反映神經元的活性,因此神經元鈣信號的檢測對研究大腦皮層功能至關重要。美國超微顯微鈣成像nVista

紫外光激發Ca2+熒光探針：Fura-2和Indo-1都是紫外光激發的雙波長Ca2+熒光指示劑，也是目前較常用的比率型鈣離子熒光探針。與其他代的熒光指示劑相比，它們的熒光信號更強，對Ca2+的選擇性也更強。比率指示劑會在與Ca2+結合后會改變吸收/發射特性。以雙波長激發指示劑Fura-2為例。如圖2所示，低Ca2+濃度下，Fura-2在~380nm處激發，高Ca2+濃度下，在~340nm處激發。光譜由兩個峰組成：左側較短波長的吸收峰隨Ca2+濃度的增加而增大，右側較長波長的吸收峰隨Ca2+濃度的增加而減小。通過340/380nm交替激發，獲取在510nm處對應的發射光熒光強度的比率，就可以對Ca2+濃度進行定量的測量。因為Fura-2結果準確，且不易被漂白，所以得到了普遍使用。美國超微顯微鈣成像nVista