COX2免疫組化IHC

熒光物質，熒光色素：許多物質都可產生熒光現象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490--495nm，較大發射光波長520--530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，結構式如下：有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用較普遍的熒光素。其主要優點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性質穩定，可長期保存。結構式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結構式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低。免疫熒光技術可以用于研究代謝疾病和內分泌系統的功能。COX2免疫組化IHC

免疫熒光間接法測抗體實驗注意事項：1）熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，會使熒光減弱。2）每次試驗時，需設置以下三種對照：①陽性對照：陽性血清+熒光標記物②陰性對照：陰性血清+熒光標記物③熒光標記物對照：PBS+熒光標記物3.已知抗原標本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物，應始終保持在已知抗原標本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。PCNA免疫抗體熒光抗體標記使得抗原定位變得可視化，有助于觀察細胞結構和功能。

免疫熒光檢測相對于酶檢測的優勢：定量熒光信號的能力（與使用基于酶的方法進行的定性測定相反）；復用能力（可以結合不同發射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質）；熒光染料的光穩定性。免疫熒光技術是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內的相應抗原（或抗體）。在組織或細胞內形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發光的照射而發生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。

其他熒光物質：1．酶作用后產生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經酶作用便形成具有強熒光的物質。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發出熒光，激發光波長為360nm，發射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經激發后也可發射特征性的熒光，其中以Eu3+應用較廣。Eu3+螯合物的激發光波長范圍寬，發射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定。所需要的儀器：熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計、流式細胞儀和時間分辨熒光計等儀器激光共聚焦顯微鏡。免疫熒光技術可以用于研究細胞凋亡和細胞存活。

免疫熒光間接法測抗體實驗步驟：滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標本片，10min后棄去，使標本片保持一定濕度。滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當稀釋的待檢抗體標本，覆蓋已知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30min。取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時振蕩。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30min。重復操作3。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結果判定同直接法。免疫熒光技術可以用于研究細胞內蛋白質的亞細胞定位。AIRE-1免疫熒光試驗

免疫熒光技術可以用于研究病毒傳播和免疫應答。COX2免疫組化IHC

檢測復雜的生物學結構需要較高清晰度的熒光信號，并將熒光信號從背景噪聲中分離開來。標準的免疫熒光標記很少能夠獲得較佳信噪比的成像效果。獲得良好圖片和較佳的可供發表的高質量圖像之間的差異就在于：需要精細調整樣品信號達到峰值特異性、高清晰度和較佳放大倍數。雖然熒光基團是進行高質量細胞成像的較佳選擇，但不可避免地也極易發生光漂白，即熒光信號的光化學降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導致數據出現偏差，產生假性結果。抗淬滅封片劑可以保護熒光標記蛋白的穩定性，維持數周乃至數月的圖像信號完整度。COX2免疫組化IHC