LC3免疫組化

熒光標記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結合一抗的檢測相比，成本較低。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應性的兩種抗體，因此物種交叉反應性問題增加；與直接免疫熒光相比，時間更長（操作步驟更多）。間接免疫熒光的優點：通過增加能夠與一抗結合的二抗數量進行信號放大；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度；熒光標記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結合一抗的檢測相比，成本較低。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應性的兩種抗體，因此物種交叉反應性問題增加；與直接免疫熒光相比，時間更長（操作步驟更多）。免疫熒光是一種常用的生物學實驗技術，用于檢測和定位特定抗原或抗體。LC3免疫組化

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性，經過短暫的間隔（發射光譜）后以較高的波長發射光子，并伴隨能量損失。發射的熒光可通過顯微鏡觀察到。熒光團可以通過可見光或紫外光激發。具有高光穩定性和熒光量子產率的熒光染料可在市場上購買，其激發較大值跨越從400到>700nm的波長范圍。它們不會損傷活細胞，可安全用于生物制劑。在進行免疫熒光檢測時，首先對細胞或組織進行固定和透化處理。進行免疫染色時，熒光團與目標抗原的抗體結合，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號。根據使用的抗體和所需的信號擴增，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型。CD80免疫檢測熒光抗體法和熒光抗原法都屬于免疫熒光技術的范疇。

熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490495nm，較大發射光波長520530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，結構式如下：有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用較普遍的熒光素。其主要優點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性質穩定，可長期保存。結構式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。

免疫熒光通過抗體與示蹤物質結合，利用抗原-抗體結合反應，進而對抗原所在的細胞或組織進行定性或定量。由于熒光素所發的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光，可以看見熒光所在的細胞或組織，利用定量技術測定含量，從而可對抗原進行細胞定性和定位分析。細胞免疫熒光用途：快速直觀顯示所檢測蛋白的細胞定位。材料與儀器：樣品：貼壁細胞；試劑：4% 組織固定液，PBS，Triton X-100，BSA，熒光二抗，免疫熒光染色二抗稀釋液，抗熒光猝滅封片液，0.25% 胰酶；器材：6/12/24 孔板，細胞爬片（蓋玻片），載玻片，15 ml 離心管。免疫熒光技術在生物學研究、醫學診斷和藥物開發等領域具有普遍應用。

細胞免疫熒光：細胞種板與細胞爬片制備：1) 細胞密度在90%-95%左右，用預熱胰酶消化細胞后重懸細胞于完全培養基中，充分吹打，使之成單細胞懸液，計數。2)取細胞培養12孔板，在每個孔放爬片的位置根據爬片的大小，先在每個孔里準備放爬片的位置滴幾滴培養基，然后將爬片置于液滴上，壓緊，使爬片與培養皿靠培養基的張力粘合到一起，防止加細胞懸液時爬片漂起，造成雙層細胞貼片。根據自己的需要選擇合適的細胞密度種入12孔板培養板內。3)24h或者48h后，根據細胞生長速度快慢，觀察判斷細胞密度，約90%時進行細胞免疫熒光。在1941年，Coons初次成功地使用熒光素作為標記物質進行免疫熒光實驗。CD80免疫檢測

免疫熒光技術可以用于研究細胞內分子的相互作用。LC3免疫組化

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