上海數字PCR原理

       要了解為什么傳統 PCR 存在限制，務必要了解 PCR 反應過程中發生了什么。基本 PCR 運行可以分為三個階段：

指數期

       每個循環積聚的產物準確加倍（假定 ** 反應效率）。該反應具有高度特異性和精確度。出現指數式擴增，因為所有試劑均新鮮可用，反應的動力學推動反應有利于擴增子加倍。

線性期（高變異性）

       隨著反應繼續，一些試劑因擴增而被消耗。反應開始減緩，并且每個循環的 PCR 產物不再加倍。

平臺期（終點：使用傳統方法進行凝膠檢測）

       反應停止，不再產生更多產物，并且如果放置時間夠長，PCR 產物將開始降解。因為每個樣品具有不同的反應動力學，所以每支試管或每個反應將在不同的時間點進入平臺期。在平臺期可以看到這些差異。在平臺期內，傳統 PCR 進行測量，又稱為終點檢測。 CRISPR-Cas9基因編輯結果驗證。上海數字PCR原理

       數字PCR采用的策略概括起來非常簡單，就是“分而治之”（divide and conquer）［1］，這種做法非常類似于計算機科學中的“分治算法”，將一個標準PCR反應分配到大量微小的反應器中，在每個反應器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA模板) ，實現“單分子模板PCR擴增”，擴增結束后，通過陽性反應器的數目“數出”目標序列的拷貝數。在實際的數字PCR實驗中，事實上是通過呈現兩種信號類型的反應器比例和數目進行統計學分析，計算出原始樣本中的模板拷貝數。南京JUE對定量數字PCR原理線性范圍達到6個數量級，靈敏度低至萬分之一。

二代測序輔助建庫

       目前靶向測序建庫方法包括擴增子方法，在均相溶液中，當擴增引物增加時，由于擴增引物之間的相互作用，從而影響擴增的效率;如果將其分散到大量微液滴中擴增，將可降低引物間相互作用，提高擴增效率。同時還可以實現對于少量模板的有效擴增，得到更多的有效測序數據。

CRISPR-Cas9基因編輯結果驗證

       CRISPR-Cas9技術的發明，是基因編輯技術的一大突破，但如何驗證實驗是否成功，仍需要高靈敏度的檢測方法，數字PCR技術可以滿足這一需求。Broad研究所張鋒團隊發明了以CRISPR為基礎的SHERLOCK技術可以對核酸進行高靈敏度的定性檢測，但精確定量評估時仍采取了數字PCR進行確認。

       數字PCR也叫Digital PCR（dPCR），是近幾年發展起來的一種核酸定量分析技術。相較于傳統熒光定量PCR來說，數字PCR對結果的判定不依賴于擴增曲線循環Ct值，不受擴增效率的影響，能夠直接讀出DNA的分子個數，能夠對起始樣本核酸分子***定量。

       數字PCR基本原理是將一個樣本分成幾十到幾萬份，然后再將其分配到不同的反應單元中，使每個微滴單元包含一個或多個拷貝的核酸分子（即DNA模板），每個單元都會對目標分子進行擴增，然后再對每個單元進行熒光信號的統計并計算。相對而言，傳統PCR或qPCR反應都是發生于同一體系當中，這也是數字PCR與其比較大的區別。 動物源性的檢測分析。

       數字PCR檢測及分析原理在上世紀90年代就被提出來了，但是無奈受限于當時的技術條件，樣本稀釋及分配都是靠手工來完成的，受到很多因素的干擾和限制；并且結果分析對于研究者來說也十分枯燥與繁瑣，因此在很長一段時間dPCR發展停滯不前。后來由于微流控技術與微納集成制造工藝的發展解決了dPCR過程中的幾個關鍵技術問題，推動了dPCR的研究與商業化的發展。

       目前根據dPCR樣本稀釋分配的方式，基本可分為三大類，一種是基于大規模集成微流控芯片；第二種是使用微反應室/孔板；第三種是微滴式。但不論是走芯片式還是微滴式，其基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或者微滴當中，每個反應器的核酸模板數少于1或者等于1。經過PCR擴增之后，有一個核酸分子的模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，可以推算出原始溶液的核酸濃度。 單張芯片一次可處理8個樣本。蘇州MicroDrop-100數字PCR解決方案

可使用第三方PCR反應液，配備PCR A300（溫度范圍4°C-98°C，擴增模塊溫控精度±0.2°C）。上海數字PCR原理

研究方向基因表達差異研究

檢測時完全不依賴傳統的Ct值即可實現真正意義上的***定量，從而提供了比實時熒光定量PCR更精確的基因差異表達研究，尤其對于那些靶基因表達差異微小的情況：microRNA、lncRNAs等的表達分析、等位基因的不平衡表達、單細胞基因表達分析、Exosome內核酸分子定量分析等。

拷貝數變異(CNV)研究

微滴化的樣品處理及檢測，這種擺脫Ct值的計算方法而直接獲取目標基因的***拷貝數，為拷貝數變異的研究提供了***的檢測精度。是其他諸如二代測序、芯片雜交等平臺無法達到的，因此采用數字PCR能夠有效對NGS、aCGH的實驗結果進行驗證，并具有成本低、通量高的特點。

上海數字PCR原理

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